1. (2024高三上·武昌期末) 大肠杆菌的mt1D基因（基因序列5^'-ATCTACGCG……TGAGTAGCG-3^'）在番茄中超量表达后，增强了番茄对冷、干旱和盐胁迫的抗性。图1为构建重组质粒的过程示意图，BamHI、BclI、SmaI、Sau3AI为限制酶（四种酶的识别序列详见表），箭头表示转录方向。回答下列问题：

限制酶	识别序列5'→3'
BamHI	G↓GATCC
BclI	T↓GATCA
SmaI	CCC↓GGG
Sau3AI	↓GATC

序列编号	M连接处测序后部分序列
Q1	5'-GGATTCCGCAGC-3'
Q2	5'-CCCGGGATCTAC-3
Q3	5'-TGATCCATCTAC-3'
Q4	5'-TGATCACGCTAC-3'

图2

1. （1） 用PCR技术扩增mt1D基因，反应体系中除加入模板、引物、dNTP、含Mg²⁺的缓冲液外，还需要加入。若PCR反应得到的非特异性扩增产物偏多，原因之一可能是退火温度（填“过低”或“过高”）。
3. （2） 为保证图中质粒A和mtlD基因正确连接构建重组质粒B，设计mtlD基因的引物时，在两种引物的5^'端分别添加限制酶的识别序列，选用限制酶切割质粒A，酶切后的载体和目的基因片段通过酶作用后获得重组质粒。
5. （3） 图2是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接，则图中M连接处的序列正确的是（填序列编号）。